6月9-10日，“2018年第七屆生物育種暨高通量篩選技術理論與應用研討會暨中國生物發酵產業協會微生物育種分會第四次學術會議”在四川成都盛大開幕。本次會議由中國生物發酵產業協會、四川省微生物學會、農業部沼氣科學研究所、四川大學與清華大學聯合主辦，清華大學無錫應用技術研究院生物育種研究中心、無錫源清天木生物科技有限公司、洛陽華清天木生物科技有限公司聯合承辦。本次大會吸引來自全國百余所高等科研院所專家、學者及企業技術負責人共計近300人參會。

大會現場

李旭峰教授致辭

清華大學邢新會教授致辭

石維忱理事長致辭

　　大會由清華大學邢新會教授主持，邢教授介紹了此次大會的相關情況，代表組委會給予各界的大力支持表示衷心的感謝。四川大學校黨委副書記李旭峰、中國生物發酵產業協會石維忱理事長代表主辦單位作了精彩致辭。在大會上作報告的部分嘉賓及內容摘要：

　　鄭裕國院士，浙江工業大學生物工程學院教授。報告題目《工業生物催化劑的篩選與應用》。內容摘要：工業生物催化劑的篩選、發現與改良是工業生物技術創新的源頭，同時也是制約其大規模應用的瓶頸。傳統的菌種篩選技術通常依賴色譜技術，處理量小、效率低、篩選周期長。如何開發高通量、高靈敏度的工業生物催化劑篩選方法是實現工業生物技術發展面臨的巨大挑戰。課題組長期從事生物催化劑的篩選、發現和應用研究。基于酶催化反應特性，建立了脂肪酶、羰基還原酶、腈水解酶、腈水合酶、酰胺酶、鹵醇脫鹵酶、羥化酶和轉氨酶等系列重要工業生物催化劑的高通量篩選技術。獲得了大量適應工業應用環境的新型、高效生物催化劑，開發成功多個大品種藥物生物催化合成新技術，取得了顯著的經濟、社會效益。

　　陳寧，天津科技大學教授：報告題目：氨基酸生產菌株選育策略與發展趨勢。內容摘要：首先對氨基酸產業現狀進行概述。然后結合課題組多年研究成果，系統介紹了氨基酸生產菌株選育技術，包括傳統育種、常規代謝工程育種、系統代謝工程育種和精確調控代謝工程育種技術。利用ARTP誘變技術和高通量篩選，獲得了一株高產尿苷的枯草芽孢桿菌。常規代謝工程育種策略可以概括為“進、通、節、堵、出”五字策略。系統代謝工程基于途徑分析、組學分析和進化策略。在代謝工程育種中，高效的基因組編輯技術不可或缺。最近，又開發出以CRISPR/dCas9介導的基因調控技術，包括基因弱化和基因強化表達。應用這些手段產生了精確調控代謝工程育種技術。利用基因整合表達和精確調控代謝工程，我們開發出四氫嘧啶和羥基四氫嘧啶高產菌株。最后介紹了氨基酸菌株選育的發展新方向。

　　張翀，清華大學副教授。報告題目：微生物基因型－表型高通量關聯技術與裝備。內容摘要：盡管在許多化學品綠色合成路線替代方面取得了重要進展，微生物制造仍面臨諸多挑戰：菌種研發周期長、大多數品種生產效率（轉化率、時空產率）仍然很低，無法滿足未來制造業“按需定制”、“高效柔性”的發展需求。下一代基因測序和核酸合成等高通量技術，結合合成生物學標準化、模塊化的策略為高效快速構建豐富多樣的微生物基因型（甚至人工合成基因組）創造了重要機遇，然而表型（功能）才是實現微生物應用核心問題，如何從海量的基因型中高效、快速獲取表型及其關聯信息仍然面臨巨大挑戰。本報告將介紹近年來我們在微生物基因型－表型高通量關聯平臺技術與裝備方面的進展，包括基于液滴微流控和小分子生物傳感的微生物工業表型高通量連續進化技術；全基因組CRISPR干擾庫篩選、核酸序列深度突變掃描等微生物基因型功能深度挖掘技術；以及我們在上述技術系統化、設備化方面的嘗試。

　　楊廣宇，上海交通大學研究員。報告題目：基于單細胞超高通量篩選的酶基因快速定向進化。內容摘要：應用合成生物學構建高效的人工生物催化體系需要具有理想功能的酶，定向進化是人工優化和塑造酶功能的重要途徑，但其效率受限于對突變庫進行高通量篩選。近年來，我們使用直徑僅有幾微米的微液滴作為微型酶反應器，發展了基于熒光激活微液滴分選（Fluorescence-activateddropletsorting，FADS)的超高通量篩選系統，可以在流式細胞儀或微流控芯片上以極高的速度對酶活性進行定量分析與篩選。針對FADS對熒光底物的特殊要求，我們提出了熒光液滴捕獲（Fluorescence droplet entrapment，FDE）底物設計原則，并針對一系列重要工業酶合成了FADS專用熒光探針。近期，我們建立了首個可直接對酶底物選擇性、立體選擇性等復雜性質進行篩選的雙通道微流控液滴分選系統(Dual-channelmicrofluidic droplet screening,DMDS)，該系統將液滴檢測和篩選部件集成在一塊微流控芯片上，能夠以1300個克隆/秒的高速度同時對兩種熒光信號進行檢測。利用DMDS系統，我們對布洛芬酯酶進行了5輪定向進化，從近500萬個隨機突變體中篩選獲得了立體選擇性提高700倍的突變酶，展示了這一體系在酶功能優化方面的能力。目前我們正在通過設計新的熒光底物、構建多酶級聯熒光檢測系統等手段，進一步擴展FADS篩選體系的應用范圍，以期它在酶工程、代謝工程、合成生物學等領域發揮更大作用。

　　彭方，武漢大學副教授。報告題目：質譜在微生物鑒定及高通量篩選中的應用。內容摘要：基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry , MALDI-TOF MS）是21世紀發展起來的一種新型軟電離質譜技術，對生物大分子進行識別和結構分析的方法。作為一種新興的蛋白質組學技術，現已廣泛應用于生命科學及相關領域，也是一項新興的微生物鑒定技術，與傳統鑒定方法相比MALDI-TOF MS具有操作簡便快速，高通量、低成本、準確等特點。通過微生物質譜數據庫的建立，MALDI-TOF MS能準確鑒定大部分細菌和真菌，特別是對一些相似度高、檢測過程復雜的菌株進行快速、精確的鑒定。另外，利用對MALDI-TOF質譜圖譜的聚類和比較分析，可以對微生物的不同菌株或不同功能活性的菌株進行高通量篩選和質量控制。

　　李晚忱，四川農業大學玉米研究所教授。報告題目：常壓室溫等離子體誘導玉米矮稈突變。內容摘要：常壓室溫等離子體是集多種誘變因素的第四態射流，可改變細胞壁和細胞膜結構和通透性，誘發DNA突變。在多種微生物誘變育種上應用，培育出生產效能更高的工業菌株。我們用改進的植物誘變等離子體發生器處理玉米萌動種子，獲得顯性突變矮稈株系。DNA重測序表明，按基因組全部堿基對計算，突變率0.083%，高于化學誘變突變率。雖然已有數十個玉米矮稈突變體及相關基因的報道，但大多屬隱性單基因突變或表現畸形，一些數量性狀位點致矮力不強，在雜交種組配中很難利用。少數數量性狀位對株高的降低程度適中，對產量等農藝性狀無明顯不良影響，但僅有少數成功克隆和功能驗證報道。為發掘更多矮稈基因型，解析矮化機理，擴增玉米株型育種種質，本項目擬結合運用常規遺傳育種與現代分子生物學技術，在驗證等離子體對植物誘變效果的同時，鑒定矮稈突變株系的致矮力、配合力及綜合農藝性狀表現，評價矮稈突變株系在玉米雜交種選育中的利用潛勢。

　　侯吉倫，中國水產科學研究院北戴河中心實驗站副研究員。報告題目：基于ARTP的牙鲆種質資源創新研究。

　　彭衛紅，四川省農業科學院研究員。報告題目：名貴珍稀食用菌羊肚菌的馴化栽培及產業化開發。內容摘要：對課題組承擔的名貴珍稀食用菌羊肚菌的馴化、配套關鍵技術研究及產業化開發的現狀、問題和趨勢等進行回顧和總結。

　　高程海，廣西中醫藥大學研究員。報告題目：基于ARTP方法篩選具有抑制甘蔗鞭黑粉菌活性的海綿共生細菌突變株研究。內容摘要：甘蔗是一種一年生或多年生熱帶和亞熱帶草本植物。中國是世界第3大甘蔗生產大國，2016年甘蔗種植面積152.7萬公頃，甘蔗產量約11382.5萬噸。對甘蔗年產量制約最大的生物因素為甘蔗鞭黑粉菌引起的甘蔗黑穗病，其已成為世界上最棘手和具有毀滅性的甘蔗病害。由于品種單一、旱地種植和宿根蔗占比大，以及對蔗種消毒和蔗田病害防治不夠重視，造成中國甘蔗黑穗病發生率逐年增加。依據發病程度不同，甘蔗黑穗病一般引起甘蔗產量損失10%-30%，發病嚴重的甚至可達到50%-70%，給中國蔗糖生產帶來巨大的安全隱患。利用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變育種儀，在誘變條件：功率120W，間距2mm，氣量10SLM，處理時間175s下誘變B.siamensis，后經篩選得到一株穩定高產化合物A的突變菌A72，其活性成分產量為38.0496 µg/mL，比原始菌株增加52.8%。利用蛋白組學的方法分析化合物A處理后菌體中蛋白變化，以1.3倍為變化閾值，t-test p-value<0.05為標準，發現差異蛋白533個，后經分析GO、KEGG通路分析，從中篩選出目的蛋白8個，結合蛋白功能初步推測化合物A主要通過影響氧化磷酸化代謝過程來達到抑制效果。

　　蘇海佳，北京化工大學教授。內容題目：綠色生物制造-復雜原料多細胞體系的人工構建。內容摘要：針對工業含糖廢水、農業廢水、餐廚垃圾等復雜底物體系，以微生物營養調控與代謝機理為關鍵科學問題，通過構建人工多細胞體系，從細胞、代謝、基因及轉錄水平對其協同作用進行深入剖析，揭示多菌群在復雜底物體系中生長代謝過程中物質、調控和信息傳遞規律，闡明復雜底物體系高效轉化/利用與多細胞體系協同效應機制。

　　堵國成，江南大學教授。內容題目：新一代工業生物技術中的高通量篩選技術與應用。內容摘要：報告概述了新一代發酵工程技術的研究進展，介紹了高通量篩選平臺技術發展情況、應用領域和高通量培養條件優化平臺的特點，重點介紹了高通量篩選在工業生物技術中的成功應用實例，并對高通量篩選技術應用進行了展望。

　　易犁，湖北大學教授。報告題目：分子改造促進蛋白在大腸桿菌和畢赤酵母中的異源分泌表達。內容摘要：蛋白在大腸桿菌和畢赤酵母中的異源分泌表達能有效簡化蛋白分離提取步驟，從而降低蛋白的工業生產成本。近來，我們通過開發新型分泌引導蛋白，以及對分泌引導蛋白前段信號肽和細胞壁構成進行分子改造有效提高了木聚糖酶、精氨酸酶、單鏈抗體等蛋白在大腸桿菌中的分泌表達；并通過輔助因子的共表達有效提升了人源溶菌酶在畢赤酵母中的分泌表達。

　　其中，通過在冰核蛋白氨基端添加多聚谷氨酸或多聚賴氨酸，從而能夠有效增加其融合表達精氨酸酶的胞外分泌量。而運用一種超折疊GFP（sfGFP）作為新的融合蛋白標簽，也能夠促進內切β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶H（Endo H）、精氨酸酶I（ARG1）、谷氨酸脫羧酶（GAD）、抗菌肽PG4等蛋白和多肽在大腸桿菌中的分泌表達，使它們的分泌表達量分別達到了0.471 g/L、0.397 g/L、0.198 g/L、0.121 g/L。此外，通過敲除類脂A合成相關基因LpxM，利用Sec途徑分泌信號肽使木聚糖酶在大腸桿菌中的簡單分泌成為可能，其胞外蛋白分泌濃度達到了0.12 g/L，活性達到3415 U/mL。同時，我們也對酵母細胞中內質網和高爾基體介導的蛋白分泌途徑進行深層次解析，并采用輔助因子協同表達等策略有效促進了溶菌酶等高經濟價值蛋白在畢赤酵母中的分泌表達。例如，利用基因劑量效應和輔助因子Pdi1，使人源溶菌酶在畢赤酵母中的分泌表達量達到了0.24 mg/mL，其針對溶壁微球菌的活性高達14120 U/mL。

　　鄧禹，江南大學教授。內容題目：大腸桿菌中高產己二酸代謝途徑的重建。內容摘要：己二酸是一種重要的二元羧酸，當前最重要的應用領域是合成尼龍類纖維（比如尼龍6,6）。預計到2018年，己二酸全球的市場價值將達到63億美元，產量約25.6億公斤。工業上己二酸的生產路線主要是硝酸氧化法，但其工藝流程長，副產物較多，污染嚴重。因此人們迫切需要尋找一種綠色，環保合成己二酸的方法。在微生物中直接生產己二酸的途徑是不存在的，人們開始合成己二酸的前體順，順-粘康酸，但順，順-粘康酸到己二酸需要金屬鉑等化學催化劑催化，因此限制了發展。進而人們開始探索己二酸的全生物合成途徑，美國的Genomatica公司和Verdezyne公司是該研究領域的領跑者，但是卻沒有透露己二酸的具體產量和產率。以往的研究均是從不同的底物間接合成己二酸，產量、產率低。而本研究是以之前在Thermobifidafusca中發現的3-氧代己二酰輔酶A途徑為基礎，通過密碼子優化6種己二酸合成過程中所需酶的基因，然后將構建好的質粒導入BL21（DE3）中進行表達，經氣相色譜質譜聯用儀及核磁鑒定為己二酸。出發菌株Mad136可產0.3g/L己二酸（轉化率為13.9%），并經確定5-Carboxy-2-pentenoyl-coa還原酶（Tfu_1647）為逆降解途徑的關鍵酶。隨后使用pTrc99a過量表達Tfu_1647基因，最終形成Mad146菌株，可產生4.3g/L己二酸，轉化率為55.5%。為了進一步的提高產量，本實驗利用CRISPR/Cas9消除途徑的主要次級代謝產物以減少碳通量競爭和敲除琥珀酸輔酶A合成酶基因以促進琥珀酰輔酶A的積累，從而增加己二酸合成的前體，最終形成菌株Mad123146。此菌株可利用甘油發酵可產生68.0g/L己二酸，比初始菌株提高了225倍，為報道的最高值。